KULTUR TISU

KULTUR TISU

PENYEDIAAN MEDIA PENGKULTURAN

Kultur tisu merupakan satu cara menghasilkan anak pokok yang lengkap bermula dengan sebahagian kecil tisu tumbuhan dalam eksplan, seperti daun, batang atau sel yang dikulturkan dalam media secara steril ataupun aseptic untuk tumbesaran. Ia juga dikenali sebagai satu teknik memelihara sel atau cebisan tisu haiwan dan tumbuhan secara in vitro. In vitro merujuk sesuatu yang dijalankan di luar badan organisma, umumnya di balang kaca ataupun tabung uji. Teknologi tisu kultur merupakan satu cara menghasilkan anak pokok yang lengkap didalam makmal yang bermula dengan pemilihan bahan untuk dikultur seperti bahagian daun, batang, pucuk atau sel tisu yang diambil dari tanaman terpilih dan dikulturkan dalam media secara steril.

Media merupakan penentu yang utama dalam penyediaan serta tumbesaran tumbuhan secara in vitro sewaktu menjalankan proses pengkulturan tisu ini. Bahagian kecil tumbuhan yang dipotong halus dalam keadaan steril akan dimasukkan kedalam bekas media pembiakan dalam petri disc. Komposisi media kultur lazimnya daripada bahan gel seperti agar - agar yang mengandungi nutrien seperti gula, vitamin, sumber karbon dan hormon pertumbuhan tumbuhan yang akan memberikan makanan kepada keratas yang akan menjadi Kalus (Calus) membesar dengan cepat bagi membentuk 'plantlet'.

Gula merupakan antara elemen penting utama yang harus ada pada media bagi melengkapkan keperluan nutrien sel atau tisu yang dikulturkan. Gula memainkan peranan yang penting dalam tumbesaran sel tumbuhan khususnya dalam metabolisma tenaga. Dalam tisu kultur, gula merupakan sumber karbohidrat yang menyediakan keadaan optimal kultur kepada pertumbuhan sel. Sumber karbohidrat ini menjadi bahan terurai untuk proses respirasi dan berfungsi dalam laluan sintetik untuk pelbagai kompoun dan juga sebagai blok pembina kepada makromolekular. Tambahan pula, karbohidrat juga mampu untuk mengawal beberapa proses untuk perkembangan sel. Antara jenis gula yang selalu digunakan sebagai sumber karbon adalah sukrosa. Sukrosa umumnya diperoleh daripada batang tebu. Secara kimia, sukrosa merangkumi unit fruktosa dan glukosa. Sukrosa dikategorikan sebagai gula yang bukan penurun yang mana tidak berkebolehan untuk dioksidakan. Sukrosa merupakan sumber karbohidrat utama yang biasa diguna dalam tisu kultur tumbuhan dan wujud secara dominan pada bahagian phloem. Bagi glukosa dan fruktosa pula, terdapat kajian bahawa jenis gula ini membantu pertumbuhan sesetengah tisu. Kehadiran karbohidrat eksogenos ini secara tidak langsung turut mempengaruhi perkembangan morfologi dan proses pembezaan tisu selain menjadi sumber tenaga dan karbon dalam media. Tambahan dengan itu, gula juga mempengaruhi tumbesaran tisu, pengaruhan dan pembezaan organ.

Vitamin juga adalah antara elemen penting yang dimasukkan di dalam penyediaan media untuk tumbesaran tumbuhan. Tumbuhan memerlukan vitamin untuk mempercepatkan proses percambahan benih. Dalam kultur tisu tumbuhan, media biasanya dicampurkan dengan vitamin seperti vitamin A, C, D dan juga vitamin B. Vitamin pada umumnya mempunyai fungsi katalitik dalam tindakbalas enzim. Vitamin dalam kumpulan B adalah vitamin yang paling banyak diperlukan dalam media untuk tumbesaran tumbuhan. Vitamin ini termasuklah thiamine (B1), niacin (B3), pyridoxine (B6), adenine (B4), cyanocobalamin (B12), D-panthothenic acid (B5) dan riboflavin (B2). Selain itu vitamin lain adalah seperti d-biotin, kolin, asid folik, asid absisik (C) dan juga vitamin E.

Makronutrien merupakan elemen penting yang digunakan oleh tumbuh-tumbuhan dan diperlukan dalam kuantiti yang besar berbanding elemen lain di dalam media. Antara makronutrien yang penting untuk pertumbuhan tumbuh-tumbuhan adalah nitrogen, magnesium, kalsium, kalium, fosforus dan sulfur.

Nitrogen merupakan elemen yang memainkan peranan penting dalam tumbesaran. Pembekalan nitrogen memberi kesan kepada pemanjangan batang dan perkembangan morfologi daun. Dalam kultur tisu, nitrogen dibekalkan dalam bentuk nitrat, asid amino, garam ammonium dan juga produk organik kompleks seperti kaseinhidrolisat. Nitrogen yang terdapat dalam kandungan media seperti nitrat dan ammonium membolehkan pH dikawal. Media dengan nitrat sebagai satu-satunya sumber nitrogen seringkali menjadi lebih beralkali pada sesuatu masa. Elemen ini juga boleh wujud sebagai ammonium atau nitrit. Oleh itu, untuk mengawal sifat alkali yang terdapat dalam media, sedikit garam ammonium perlu ditambah. Selain itu, pengimbangan ammonium atau nitrat yang betul akan meransang morfogenesis dan embryogenesis.

Magnesium biasanya diambil dalam magnesium sulfat. Ia adalah komponen struktur klorofil dan diperlukan untuk mengekalkan sifat ribosom dan asid nukleik dan juga kestabilan membran sel. Hal ini secara tidak langsung menjadikan magnesium turut terlibat dalam mempengaruhi proses fotosintesis. Magnesium mempunyai tindakbalas yang kuat dengan kalsium dalam media dan juga dengan mangan.

Kalsium ialah komponen dinding sel, membran dan lignin. Dinding sel dalam tumbuhan kebanyakannya dibuat daripada unsur kalsium. Kalsium berfungsi untuk menguatkan dan menstabilkan dinding sel dan mengawal permukaan dinding sel. Oleh itu, kekurangan kalsium akan menyebabkan membran sel terurai. Kalsium juga terlibat dalam pembahagian sel dan pemanjangan sel. Ia juga memainkan peranan penting dalam tindak balas phytochrome di samping terlibat dalam sintesis dinding sel.

Kalium biasanya disediakan dalam bentuk kalium dihidrogen fosfat. Dalam sitoplasma, kalium mengaktifkan banyak enzim termasuk beberapa jenis enzim yang terlibat dalam glikolisis dan sintesis protein. Kalium di dalam sitoplasma diperlukan untuk memaksimakan proses fotosintesis, mengawal proses-proses pengangkutan membran dan mengawal pH pada sitoplasma. Di dalam vakuol, kalium memainkan peranan utama dalam kawalan turgor.

Fosforus ialah komponen utama dalam membran biologi dalam fosfolipid dan dalam asid nukleik. Fosforus biasanya diambil dalam kompaun dihidrogen fosfat. Fosforus penting untuk metabolisma tenaga dalam sel dengan membentuk tenaga yang kaya fosfat ester. Selain itu, fosforus memainkan peranan penting dalam fotofosforilasi, glikolisis dan dalam laluan pentose fosfat.

Mikronutrien juga merupakan elemen penting yang digunakan oleh tumbuh-tumbuhan namun diperlukan dalam jumlah yang agak kecil bagi pertumbuhan tumbuh-tumbuhan. Antara mikronutrien yang penting untuk pertumbuhan tumbuh-tumbuhan adalah boron, klorin, kuprum, zink, mangan, molibdenum dan besi.

Pengawal atur pertumbuhan tumbuhan merupakan sebatian organik yang umumnya terhasil secara semulajadi yang mempengaruhi pembesaran dan perkembangan tumbuhan. Penambahan elemen ini ke dalam media kultur tisu adalah penting untuk menyokong pertumbuhan tisu yang lebih baik khususnya yang hidup dalam keadaan in vitro. Namun keperluan bahan ini adalah berbeza bagi tumbuhan yang berlainan kerana dipercayai bergantung kepada paras hormon endegenos tumbuhan tersebut . Terdapat lima kelas pengawal atur tumbuhan iaitu auksin, sitokinin, giberelin, asid absisik dan etilena. Auksin dan sitokinin umumnya terlibat secara langsung dalam perkembangan tisu tumbuhan dan memainkan peranan penting dalam kejayaan pertumbuhan secara in vitro. Auksin penting untuk merangsang pemanjangan sel di bahagian hujung meristem, pembelahan sel dan juga terlibat dalam penghasilan dinding sel. Selain itu, auksin membantu dalam mempercepat proses pertumbuhan akar atau batang. Sitokinin memainkan peranan penting khususnya dalam pengaruhan pucuk, pembentukan kalus dan juga dalam pembelahan sel. Etilena terlibat dalam pengabsisan dan penting untuk proses pematangan buah. Kehadiran asid absisik dan giberelin adalah hanya kadang kala digunakan dalam kajian tisu kultur untuk spesies tumbuhan tertentu.

Penggunaan hormon sintetik umumnya mampu mengaruh perubahan kepada bahagian sensitif genome tumbuhan Hasil daripada kaedah ini adalah serba serupa dengan induknya dan ia mewarisi sifat-sifat pokok induknya dan mengekalkan ciri-ciri asalnya. Jikalau didapati anak pokok yang dihasilkan berbeza daripada induknya, ini mungkin terjadi pada bahagian-bahagian tertentu seperti bunga dan daunnya. Misalnya induk yang berdaun lurus menghasilkan anak pokok yang daunnya sedikit melengkung dan sebagainya.Walau bagaimanapun, ini adalah jarang berlaku.

Tidak semua jenis sel atau tisu boleh dikulturkan. Penyediaan media juga harus dijalankan dengan teliti bergantung kepada keperluan tumbuhan terhadap ramuan untuk menghasilkan kalus dan organagenesia. Pensterilan yang sempurna harus dijalankan ke atas sel dan medium yang digunakan untuk menggelakkan pertumbuhan mikroorganisma. Keadaan fizikal media yang digunakan amat mempengaruhi perkembangan kalus. Jenis media merupakan faktor penting kerana kuantiti dan jenis nutrien yang dibekalkan mempengaruhi tumbesaran eksplan kultur. Justeru, pemilihan media yang sesuai adalah langkah kritikal dalam kerja tisu kultur. Umumnya, media pepejal digunakan dengan tambahan agar sebagai gelling agent. Kepekatan agar mempengaruhi kekerasan media yang mana juga akan mempengaruhi pertumbuhan kalus. Kepekatan agar yang tinggi akan menyebabkan media menjadi terlalu keras dan menghalang resapan nutrien ke dalam tisu. Manakala, kepekatan agar yang rendah akan membentuk lapisan cecair di atas media.

Larutan stok media umumnya disediakan dalam kepekatan yang tinggi daripada kepekatan asal media yang diperlukan. Hal ini bertujuan untuk memudahkan pencairan dibuat mengikut kepekatan media yang diperlukan. Ia juga akan dapat menjimatkan masa dan tenaga di samping dapat mengurangkan risiko ralat ketika menimbang atau mengukur bahan-bahan yang diperlukan dan sangat berkesan kerana tidak perlu menyediakan larutan tersebut berulang kali.

Rujukan :

http://cool-ron98.freeservers.com/kulturtisu.htm
http://animhosnan.blogspot.com/2012/03/apa-itu-tisu-kultur.html
http://syakas22.blogspot.com/2008/02/kultur-tisu.html